PENGENALAN DAN PENGGUNAAN ALAT PENGAMBILAN CONTOH AIR

I.                   Pendahuluan

1.1              Latar Belakang

Bakteri  mempunyai morfologi, struktur dan sifat-sifat yang khas. Bakteri merupakan mikroorganisme yang berukuran mikroskopik. Selain mikroskopik, bakteri juga hampir tidak berwarna atau transparan dan kontras dengan air. Sehingga melihat dan mengamati bakteri dalam kedaan hidup sangat sulit. Bakteri dapat diklasifikasikan menjadi aerob dan anaerob. Perbedaan utama antara kedua adalah kenyataan bahwa bakteri aerobik membutuhkan oksigen untuk tetap hidup, sementara bakteri anaerob tidak bergantung pada oksigen untuk proses metabolisme dan kelangsungan hidup. Sedangkan aerob dapat berkembang di habitat yang memiliki oksigen berlimpah, anaerob dapat mati dalam dengan adanya oksigen. Jenis bakteri memang memiliki keunggulan pertumbuhan area tubuh tidak terpapar oksigen, dan mereka bisa menjadi patogen virulen. Perbedaan kapasitas untuk memanfaatkan oksigen antara aerob dan anaerob penting dalam pengobatan infeksi tubuh (Lay, 1994)

Identifikasi dan determinasi suatu biakan murni bakteri yang diperoleh dari hasil isolasi dapat dilakukan dengan cara pengamatan sifat morfologi koloni, morfologi sel bakteri, pengujian sifat-sifat fisiologi dan biokimianya. Selain itu, identifikasi juga dapat dilakukan dengan penguraian sifat patogenitas dan serologinya. Pertumbuhan bakteri di alam dipengaruhi oleh beberapa faktor luar seperti susbtrat, pertumbuhan , pH, temperatur, dan bahan kimia. Bakteri yang nampak dapat memiliki morfologi yang sama, namun keperluan nutrisi dan persyaratan ekologinya berbeda. Untuk pengamatan morfologi bakteri dengan jelas ,tubuhnya perlu diisi dengan cat warna, pewarnaan ini disebut pengecatan ekteri (Ratna,1990).

 Karakterisasi merupakan salah satu kegiatan yang dilakukan untuk mengobservasi bakteri maupun kapang hasil isolasi (isolat). Kegiatan karakterisasi dapat dilakukan berdasarkan sifat sitologi (bentuk sel, gerak atau motilitas, sifat Gram dan endospora), sifat morfologi, dan sifat fisiologi. Uji sifat morfologi mencakup sifat-sifat koloni, seperti ukuran, bentuk, warna dan tepian, sedangkan uji sifat fisiologi diantaranya uji hidrolisis pati, hidrolisis lemak, hidrolisis protein dan uji katalase (Subandi, 2009).

            Uji fisiologis bakteri dilakukan untuk mengidentifikasi bakteri berdasarkan aktivitas selnya. Bakteri yang dapat menghidrolisis pati mempunyai aktivitas amilolitik, yaitu menghasilkan enzim amilase yang dapat mengubah pati menjadi molekul-molekul gula sederhana (monosakarida) untuk kebutuhan metabolisme sel. Aktivitas tersebut ditandai dengan adanya zona bening di sekeliling koloni pada uji hidrolisis pati (Hadioetomo, 1993). Dalam kegiatan pratikum kali ini yang akan dilakkan adalah uji fluoresensi, uji gram positif dan negative, uji virulensi dan uji pembususkan pada kentang.

Uji Fluoresensi adalah uji yang dilakukan pada media King’s B untuk mengetahui suatu bakteri tergolong dalam kelompok bakteri berpendar atau tidak. Media King’s B adalah media yang miskin Fe. Dengan demikian, akan memacu bakteri untuk berpendar agar dapat menyerap Fe. Uji virulensi adalah untuk menguji apakah suatu pathogen tersebut tergolong bakteri virulen atau avirulen. Pengujian ini dilakukan dengan menggunakan media TZC (Tetra Zolium Chloride). Jika virulen, maka bakteri akan berwarna pink dengan pinggir putih sedangkan yang avirulen akan terbentuk koloni berwarna merah.

Pewarnaan Gram (Gram Stain), yang dapat digunakan untuk memisahkan anggota- anggota dominan bakteria ke dalam dua kelompok berdasarkan perbedaan dinding selnya. Bakteri gram positif memiliki dinding sel yang lebih sederhana,dengan jumlah peptidoglikan yang relatif banyak. Dinding sel bakteri gram-negatif memiliki peptidoglikan yang lebih sedikit dan secara struktural lebih kompleks. Membran bagian luar pada dinding sel gram-negatif mengandung lipopolisakarida, yaitu karbohidrat yang terikat dengan lipid. Diantara bakteri patogen,yang menyebabkan penyakit, spesies gram-negatif umumnya lebih berbahaya dibandingkan dengan spesies gram-positif. Untuk uji pembusukan kentang dilakukan dengan menginokulasikan inokulum kemedia kentang yang sehat.

1.2 Tujuan

            Adapun tujuan dalam pratikum kali ini adalah untuk mengetahui jenis bakteri yang tergolong bakteri virulen/avirulen, gram positif/negatif, berpendar/tidak dan mengetahui jenis bakteri yang dapat membusukkan kentang. Selain itu, untuk mengetahui teknik dalam proses pengujian tersebut.

II.                METODOLOGI

2.1              Waktu Pelaksanaan

            Pratikum ini dilaksanakan pada Senin, 5 Mei 2014 bertempat di Laboratorium CB BIO Kampus Cilibende Diploma Institut Pertanian Bogor.

2.2       Alat                                         Bahan

            Cawan petri                             Inokulum Bakteri Pseudomonas fluorescent

            Jarum Ose                               Inokulum Bakteri Ralstonia solanacearum

            Bunsen                                    Sil

            Cover glass                              Kentang

                                                            Tisu

                                                            Sedotan

                                                            Wortel Busuk

                                                            Media TZC dan King’s B

                                                            Alkohol

                                                            Air

2.3              Langkah Kerja

2.3.1        Uji Fluoresensi

a)      Siapkan alat dan bahan

b)      Besihkan tempat dan tangan pratikan dengan menggunakan alkohol 70%

c)      Panaskan media berisi bakteri Pseudomonas fluorescent didekat bunsen sambil melepaskan ikatan silnya

d)     Panaskan jarum ose  lalu dikering-anginkan

e)      Ambil inokulum lalu lakukan penggoresan bakteri pada media King’s B sesuai pola

f)       Tutup media yang telah digoreskan bakteri dengan sil

g)     

Lakukan pengamatan pola pembentukan koloninya

                                                                                                (2)

                                    (1)

                        (3)                                                                    (4)

2.3.2 Uji Virulensi

a)      Siapkan alat dan bahan

b)      Besihkan tempat dan tangan pratikan dengan menggunakan alkohol 70%

c)      Panaskan media berisi bakteri Ralstonia solanacearum didekat bunsen sambil melepaskan ikatan silnya

d)     Panaskan jarum ose  lalu dikering-anginkan

e)      Ambil inokulum lalu lakukan penggoresan bakteri pada media TZC sesuai pola

f)      

Tutup media yang telah digoreskan bakteri dengan sil

g)     

Lakukan pengamatan pola pembentukan koloninya

(1)                                                                     (2)

(3)                                                                    (4)

2.3.2        Uji Gram Positif dan Negatif

a)      Ambil objek glass dan tetesi KOH 3% 1 tetes

b)      Ambil biakan menggunakan jarum ose yang telah dibakar lalu diaduk pada cover glass tersebut

c)     

Setelah homogen, lalu angkat jarum ose tersebut. Apabila lengket dan berlendir maka tergolong bakteri gram negative

(1)  

                                                                              (2)                               

(3)                                                                    (4)

            (5)                                                                    (6)

2.3.3        Uji Pembusukan Bakteri pada Kentang

a)      Sediakan alat dan bahan

b)      Basahi tisu dengan sedikit air hingga lembab lalu letakkan dalam cawan petri

c)      Letakkan  sedotan diatas tisu secara vertikal dan horizontal

d)     Potong kentang bentuk bulat dan letakkan didalam cawan petri yang telah terdapat sedotan dan tisu

e)      Inokulasikan inokulum diatas kentang tersebut. Lakukan sesuai perlakuan apakah Pseudomonas fluorescent, Ralstonia solanacearum, wortel busuk ataupun air

f)       Tutup cawan petri dan lapisi dengan sil

(1)  

                                                                  (2)

(3)                                                                    (4)

                                    (5)                                                        (6)

III.             PEMBAHASAN

3.1              Uji virulensi

Kelompok	Waktu Inkubasi (hari)
1	1
2	-
3	1
4	1
5	1

Nb: kelompok 2 tidak mendapat perlakuan uji virulensi

            Uji virulensi dilakukan untuk mengetahui kelompok bakteri yang tergolong virulen atau avirulen. Artinya, apakah bakteri tersebut menjadi patogen bagi tanaman atau tidak. Pengujian ini dilakukan dengan menginokulasikan bakteri Ralstonomia solanacearum     pada media TZC. Isolat R. solanacearum cepat kehilangan virulensi ketika dipelihara pada media laboratorium. Namun, organisme dengan mudah dapat dipertahankan selama bertahun-tahun dalam air suling steril atau miring agar-agar ditutupi dengan minyak mineral steril dan disimpan pada suhu kamar. Jadi alasan TZC digunakan untuk Ralstonia solanacearum adalah supaya lebih mudah diisolasi dan organisme dengan mudah dapat dipertahankan selama bertahun-tahun.

            Dalam pratikum yang telah dilaksanakan, rata-rata waktu inkubasi yang ditunjukkan sampai terjadi gejala adalah 1 hari. Dimana, dalam waktu 24 jam tersebut telah terdapat koloni bakteri berwarna merah yang menunjukkan bahwa bakteri ini tidak bersifat virulen (G1). Hal ini sesuai pernyataan bahwa bakteri yang virulen menunjukkan bentuk koloni tidak beraturan, berlendir warna merah muda dibagian tengah, dan dikelilingi lendir berwarna putih susu kotor dengan elevasi dari permukaan koloni agak sedikit konveks. Sedangkan koloni nonvirulen berwarna merah dan merah kebiruan atau ungu, tidak berlendir dan elevasi agak menonjol (Brown et al.1980).

            Bakteri R. Solanacearum akan tumbuh membentuk koloni. Ciri-ciri koloni bakteri berbentuk bulat cembung, pinggir rata, berwarna putih susu kebasah – basahan. Karakteristik bakteri R. Solanacearum adalah memliliki gram negatif, berbentuk batang lurus atau bengkok, ukuran (0,5 – 1,0 μm) x (1,5 – 4,0 μm) memiliki satu atau lebih flagela polar, katalase positif dan bersifat aerobik. Namun identifikasi bakteri ini sangat sulit dan memerlukan kombinasi uji fisiologi biokimia, media selektif dan uji patogenetitas. Sedangkan bakteri patogen lain relatif lebih sederhana dan hanya memerlukan beberapa pengujian (Mehan, 1995).

3.2              Uji Gram Bakteri

            Secara teoritis gram (+) memiliki dinding sel yang tebal dan lemak yang tipis sedangkan gram (-) berlemak tebal dan berdinding sel tipis yang berada di ruang periplasma. KOH akan menyerang lemak (bilayer lipid) ini dan membuat sel gram (-) pecah. Pecahnya sel melepaskan materi genetik (DNA) yang merupakan substansi melimpah di dalam sel bakteri. Molekul DNA sangat panjang bersifat sticky strings (menyerupai lendir, getah atau dapat berarti lengket) yang memberikan hasil seperti lendir saat diangkat dengan jarum inokulum (Edwin, 2011). 

Pewarnaan gram dan spora dapat dilakukan dalam uji sifat sitologi suatu bakteri. Prinsip pewarnaan gram adalah kemampuan dinding sel terhadap zat warna dasar (Kristal violet) setelah pencucian alkohol 96%. Bakteri gram positif terlihat berwarna ungu karena dinding selnya mengikat kristal violet lebih kuat, sedangkan sel gram negatif mengandung lebih banyak lipid sehingga pori-pori mudah membesar dan kristal violet mudah larut saat pencucian alkohol. Pewarnaan spora dilakukan untuk mengetahui ada atau tidaknya spora pada bakteri. Spora dapat terbentuk saat kondisi tidak memungkinkan pertumbuhan bakteri. Spora juga mampu mengikat warna lebih cepat dan sukar melepaskannya (Fardiaz 1989).

Pada umumnya jarang atau tidak terjadi kebingungan dalam memutuskan adanya lendir atau tidak meskipun beberapa kultur bereaksi secara lambat. Namun jika bakteri yang dicampur terlalu sedikit, dikhawatirkan hasilnya akan salah. Lebih baik pada saat melakukan uji ini menggunakan latar belakang warna hitam. Metode ini tidak disarankan pada kultur yang berusia beberapa minggu.Dari uraian tersebut, dapat dinyatakan bahawa penentuan sifat gram dengan KOH 3% (disebutKOH string test) memiliki hasil yang sama dengan pewarnaan gram. Keunggulannya jelas terlihat yaitu sederhana, praktis, dan tidak time-consuming. Namun kekurangannya antara lain:

1.      Tidak dapat sekaligus mengecek morfologi selnya sehingga tidak dapat mengetahui adanya kontaminan pada kultur yang tidak diketahui jenisnya.

2.      Kultur (sel) yang digunakan lebih banyak daripada pewarnaan gram. Hal ini akan menimbulkan masalah jika bakteri uji memiliki koloni tunggal yang kecil dan adapula yang merekat dengan agar.

3.      Tidak dapat mendeteksi gram variabel (telah dijelaskan).

            Pada pratikum yang dilaksanakan, uji gram bakteri Pseudomonas fluorescent menunjukkan hasil berlendir dan lengket sehingga mengindikasikan bakteri ini tergolong kedalam bakteri gram negatif. Sedangkan pengujian pada bakteri Ralstonia solanacearum tidak menunjukkan gejala berlendir dan lengket.

3.3              Uji Pembusukan Bakteri pada Kentang

           

Kelompok	Waktu inkubasi	Sumber inokulum
		Pseudomonas Fluorescent	Ralstonia solanacearum	Wortel busuk	Air
1	-		√
2	-	√
3	3			√
4	-				√
5	-	√

            Berdasarkan tabel diatas, dapat diketahui bahwa diantara keseluruhan inokulum hanya wortel busuk saja yang dapat membusukkan kentang dalam jangka waktu 3 hari, sedangkan inokulum lain belum mampu untuk membusukkan kentang. Menurut Lelliot & Stead (1987), Pseudomonas sp hanya menyebabkan lubang yang dangkal, sedangkan Erwinia sp.menyebabkan lubang yang dalam dan berlendir. Jadi dapat dikatakan bahwa media wortel busuk yang digunakan mengandung erwinia sp sehingga dapat membusukkan kentang. Seperti pada G2, dapat dilihat bahwa dengan perlakuan kelompok kami yakni dengan inokulum Pseudomonaas fluorescent, kentang masih belum menunjukkan kondisi busuk.

            Pseudomonas sp. (Pseudomonas kelompok fluoresent) adalah bakteri Gram-negatif dan bersifat aerob. Mikrobial antagonis yang penting dalam pengendalian biologi patogen tanaman adalah bakteri Pseudomonas fluorescenst, karena bakteri tersebut memiliki kelebihan yaitu mempunyai pertumbuhan yang lebih cepat, menghasilkan antibiotik serta mampu menggunakan substrat yang berbeda-beda dibandingkan kelompok bakteri patogen. Pseudomonas kelompok fluorescens mempunyai kemampuan menghasilkan pigmen berwarna kuning sampai hijau atau biru pada medium King's B. Kemampuan menghasilkan pigmen tersebut merupakan salah satu kriteria yang digunakan para ahli mikrobiologi dalam memilih Pseudomonas yang bermanfaat karena pigmen tersebut biasanya dihasilkan oleh spesies-spesies penghasil senyawa antibiotik. Beberapa kelompok Pseudomonas berasosiasi dengan tanaman sebagai penghuni rizosfer (Kiewnick & Sands dalam Schaad 2001). Pada tanaman terinfeksi maupun tidak terinfeksi, keduanya bersifat patogen. Erwinia sp. sering menyerang jaringan tanaman yang hidup, bersifatpatogen pada tanaman sayuran seperti menyebabkan gejala busuk lunak (Janse, 2005). Erwinia sp. termasuk dalam famili Enterobacteriaceae, bersifat anaerobfakultatif, dan Gram-negatif. Pada tanaman terinfeksi,  Erwinia sp. yang diidentifikasi bersifat pathogen.

KESIMPULAN

Dari pratikum yang telah dilaksanakan dapat diketahui bahwa:

1.                  Untuk mengidentifikasi suatu bakteri perlu dilakukan pengujian. Salah satunya dengan uji fisiologis yang meliputi uji fluoresensi, uji pembusukan bakteri pada kentang, uji gram bakteri dan uji virulensi

2.                  Bakteri pseudomonas fluorescent tergolong bakteri berpendar, sedangkan Ralstonia solanacearum tidak

3.                  Bakteri Ralstonia solanacearum tergolong bakteri avirulen

4.                  Bakteri pseudomonas fluorescent tergolong bakteri gram negative (-) , begitu pula Ralstonia solanacearum

5.                  Bakteri Pseudomonas fluorescent, Ralstonia solanacearum dan air tidak dapat membusukkan kentang. Hanya wortel busuk yang dapat membusukkan kentang

                                                  

DAFTAR PUSTAKA

Edwin. 2011. Materi Kuliah Mikrobiologi. Universitas Lambung Mangkurat,          Banjarbaru.

Fardiaz, S. 1989. Mikrobiologi Pangan. IPB, Bogor.

Hadiotomo, Ratna Siri., 1990. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek. Pt.Gramedia,   Jakarta

Hadioetomo,R.S.1993.Teknik dan Prosedur Dasar Laboratorium    Mikrobiologi.Jakarta: Gramedia.

Lay, Bibiana W.,1994.Analisis mikroba di laboratorium. PT. Raja Grafindo,           Jakarta.

Mehan V.K. and D.Mc Donald. 1995. Techniques for diagnosis of Pseudomonas solanacearum and for resistance screening Against Groundnut Bacterial          Wilt. ICRISAT. Andhara Pradesh.

Michael J. Pelczar, dan E.C.S. Chan. 2008. Dasar-dasar Mikrobiologi. Ui-Press,    Jakarta

Subandi. 2009. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Gunung Djati Press,Bandung.